SILAC-IP免疫共沉淀实验原理

在分离纯化诱饵蛋白-互作蛋白复合物过程中，不可避免地会出现非特异结合蛋白，这些蛋白会一并被质谱鉴定出来，成为假阳性的互作蛋白，影响后续挑选验证。 传统的判断假阳性互作蛋白方法是：用诱饵蛋白组鉴定到的蛋白列表，扣除掉对照组鉴定到的蛋白列表，作为“互作蛋白”。但很多真实的互作蛋白，比如丰度比较高的蛋白，在对照组中也会出现，而传统的方法就会被排除掉。

SILAC技术是先将实验组和对照组的蛋白带上不同的同位素，即重链、轻链**酸蛋白。复合物分离后，混在同一管中做酶切质谱等。这样既能鉴定到复合物蛋白，又能根据同位素峰强度判断诱饵蛋白组和对照组中蛋白的相对含量，从而更准确地判断出互作蛋白。

SILAC-IP实验技术方案

不同的实验背景和目的需对应用不同方案，辉骏生物提供以下三种SILAC-IP实验方案：

方案一：以野生型细胞株为实验材料

1．分别用轻、重链**酸培养细胞，取等量标记好的细胞提取蛋白质；
2．提取的轻链、重链细胞总蛋白分别用Normal IgG和抗bait蛋白的特异抗体做Co-IP；
3．混合轻、重链Co-IP产物；
4．胰酶酶切，LC-MS/MS鉴定和定量蛋白。

方案二：以过表达诱饵蛋白的细胞株为实验材料

1. 分别用轻、重链**酸培养正常对照细胞和过表达诱饵蛋白的细胞株(带标签)，取等量标记好的细胞分别提取蛋白质，并再次定量；
2. 取等量蛋白混合，用诱饵蛋白抗体做Co-IP；
3. 收集Co-IP后的蛋白液，胰酶酶切，LC-MS/MS鉴定和定量蛋白。

方案三：以干扰诱饵蛋白的细胞株为实验材料

1. 分别用轻链、重链**酸培养RNAi 诱饵蛋白的细胞株和正常对照细胞株，取等量标记好的细胞分别提取蛋白质，并再次定量；
2. 取等量蛋白混合，用诱饵蛋白抗体做Co-IP；
3. 收集Co-IP后的蛋白液，胰酶酶切，LC-MS/MS鉴定和定量蛋白。

应用领域

应用背景

用SILAC结合免疫共沉淀（CoIP）寻找相互作用蛋白是SILAC在定量蛋白质组学研究基础上的进一步应用，称之为SILAC-IP技术。该技术通过质谱鉴定和分析蛋白质相对量来判断是否是特异性结合诱饵蛋白，当实验组与对照组中某个蛋白质量含量达到统计学的差异时，就判定这个蛋白质与诱饵蛋白质具有相互作用。

传统方法在判断假阳性互作蛋白时，很容易将一些在实验组和对照组中同时出现的真实互作蛋白当做假阳性互作蛋白排除掉，SILAC-IP技术将实验组和对照组的蛋白带上不同的同位素，结合质谱分析，既能鉴定到复合物蛋白，又能根据同位素峰强度判断诱饵蛋白组和对照组中蛋白的相对含量，从而更准确地判断出互作蛋白。

相较于传统的免疫共沉淀和pull down技术，SILAC-IP技术特异性强，假阳性极低，通量高，灵敏度高，能直接检测出与bait蛋白互作的其他蛋白的相对含量；适合于可传代细胞，尤其是易转基因细胞。