DNA pull down实验原理

先将含脱硫生物素的DNA pulldown探针结合到链霉亲和素Beads上，再将DNA-Beads和细胞裂解液孵育，这样DNA结合蛋白便一起吸附在Beads上。洗涤掉未结合的蛋白后，再用洗脱液将DNA结合蛋白从Beads洗脱下来，得到DNA pull down产物。DNA-protein复合物既可以用WesternBlot检测已知蛋白，也可以用质谱鉴定未知蛋白。

DNA pull down实验步骤流程

应用领域

DNA pull-down技术服务应用背景

DNA pull-down以感兴趣的DNA序列为中心，寻找与该序列结合的蛋白质，好常见的应用是寻找某特定基因启动子区域的转录因子。

启动子通常位于结构基因5'端上游，含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列。

转录因子也称为反式作用因子，是一种DNA结合蛋白，它能够与真核基因的顺式作用元件（如启动子、增强子等）特异性结合来激活或抑制基因表达。转录因子有4个主要结构域：DNA结合域决定了转录因子的特异性，转录调控域（包括激活域或抑制域）决定了转录因子的功能，寡聚化位点使不同转录因子间发生相互作用，核.信号控制转录因子进入细胞核。

一个基因的启动子通常会结合多种转录因子，寻找启动子序列的特异转录因子，有助于我们理解这些启动子下游的功能基因是如何被调控的。

DNA pulldown技术实验服务—客户案例

lncRNA LAMP5-AS1通过调控DOT1L甲基转移酶活性促进MLL白血病发展

研究背景

鼻咽癌的已有研究指出，氯离子通道-3(CLC-3)是一种有应用前景的癌症生物标志物；但是，CLC-3能否作为胃癌的预后生物标志物以及它在胃癌中的作用机制却鲜有报道。

研究路线

1

免疫组化实验表明CLC-3在胃痦组织中高表达，且与患者不良预后有关

2

RNA-seq分析和细胞实验发现敲除CLC-3抑制细胞增殖和迁移，且影响了PI3K/Akt信号通路的很多基因

3

双荧光素酶实验确定了CLC-3启动子的活性区域

4

DNA pull down MS实验找到了CLC-3启动子活性区域的潜在结合蛋白XRCC5

5

体内DNA探针检测和ChIP-PCR实验都确定了XRCC5蛋白可以结台CLC-3启动子

6

免疫组化实验表明XRCC5和CLC-3的表达呈正相关，且两者高表达指示患者预后不良

7

基因表达/敲除和细胞功能实验结果显示CLC-3的表达和功能受XRCC5的调节

8

CoIP结合质谱实验筛选到了XRCC5的互作蛋白PARP1，体内DNA探针检测发现PARP1也可以与CLC-3启动子结合，XRCC5和PARP1协同调控CLC-3的表达和功能

9

小鼠移植瘤实验表明CLC-3在体内可也以被XRCC5调控，影响肿瘤生长

研究结论

CLC-3过表达是胃癌不良预后的生物标志物，并且CLC-3可能通过PI3K/AKT信号通路调节细胞增殖和迁移。胃癌中CLC-3过表达的调控机制是：XRCC5结合CLC-3启动子区并增加其启动子活性，并且与PARP1相互作用在转录水平正调控CLC-3的表达。

客户文献

Gu Z.Y. et al: Overexpression of CLC-3 is regulated by XRCC5 and is a poor prognostic biomarker for gastric cancer. Journal of Hematology & Oncology. 2018. (IF=17.388).