TAP-MS串联亲和纯化质谱实验原理

过表达TST-Flag双标签融合蛋白的细胞，经裂解后先与Streptactin珠子孵育、初次洗涤及洗脱，释放出蛋白复合物；再将此蛋白复合物与anti-Flag珠子结合、再次洗涤，好后的洗脱产物用质谱鉴定未知的互作蛋白。

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TAP-MS串联亲和纯化质谱实验流程

应用领域

TAP MS应用背景

随着确定细胞内蛋白质的相互作用成为当今生命科学的研究热点，双杂交技术已经广泛应用于研究蛋白—蛋白间的相互作用，但由于其筛选步骤复杂，假阳性结果较多，难于量化，故不能满足大规模蛋白质研究的需要，因此串联亲和纯化（TAP）技术以其高效、高纯度、以及能够高度模拟真实生理条件等优势，迅速成为筛选、发现和鉴别新的相互作用蛋白质的主流技术之一。

目前，TAP技术与质谱技术的联用，以及质谱技术的自动化，使得大规模地分析相互作用的蛋白质在技术上成为可能。

TAP技术采用两步亲和纯化，提高了纯化产物的特异性，具有周期短、假阳性结果少等优点。通过这种方法鉴定到的蛋白质相互作用能真实地反映出细胞中蛋白质分子之间的联系，实验结果更加接近真实情况，而且TAP技术还特别适用于蛋白质组水平上的大规模研究。

TAP-MS实验研究案例—客户文章解析

鸟嘌呤核苷酸交换因子的差异rac1信号涉及FLII在调节rac1驱动的细胞迁移中的作用

研究背景

 

小的GTP酶 rac1与肿瘤的形成和扩散有关。当被鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)激活时，rac1与细胞中的各种蛋白质结合，从而调节各种功能，包括细胞迁移。然而，当在临床环境中以rac1为靶点时，rac1的激活可以导致相反的迁移表型，增加了加剧肿瘤进展的可能性。这就需要确定影响rac1驱动的细胞运动的因素。

研究路线

1

过表达与 pull down实验证实Tiam1和P-Rex1诱导不同的rac1下游效应

2

通过TAP/ SILAC结合的方法检测 Tiam1或 P-Rex1诱导后的rac1相互作用体，证实Tiam1和P-Rex1对racl互动体有不同的调控作用

3

免疫共沉淀、 GST pull down和PLA实验结果证实FLII优先与活性racl结合FLII是一种新的富含P-RExl的rac1结合伙伴

4

结构域分析证实FLII通过不同的结构域与rac1和P-Rex1结合

5

Pull down实验和细胞迁移实验证实FLII是P-REx1-rac1驱动的细胞迁移所必需的

6

基因敲除实验表明P-Rex1可以通过FLII介导特定的细胞功能，包括细胞收缩，从而促进细胞迁移

研究结论

研究证实P-Rex1不仅能激活rac1，而且还能将蛋白质(如FLII)定向到rac1的活性形式，以介导特定的细胞功能，包括细胞收缩，从而使P-Rex1能够促进细胞迁移。因此，这项研究提供了对以前未报道的P-REx1-rac1介导细胞迁移的细胞功能的洞察力，并强调了P-Rex1和rac1可能驱动癌症扩散的其他模式。

客户文献

Hadir Marei. et al: Differential Rac1 signalling by guanine nucleotideexchange factors implicates FLII in regulating Rac1-driven cell migration.Nat Communications. 2016，IF=14.919.