RNA pull down实验原理

先将体外转录的RNA结合到Beads上，再将RNA-Beads和细胞裂解液孵育，这样与目标RNA结合的蛋白便会一起吸附在Beads上。洗涤掉不结合的蛋白后，用洗脱液将RNA-protein复合物从Beads洗脱下来，之后可以采用Western Blot技术检测特定的结合蛋白，还可以采用质谱方法鉴定与目标RNA结合的未知蛋白。

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RNA pull down实验原画步骤流程

应用领域

RNA pull down应用背景

RNA结合蛋白（RNA binding protein，RBP）是一类功能强大而广泛的调节因子，约占细胞编码的所有蛋白的5%~10%。目前除了少数RNA以核酶形式单独发挥功能，大部分RNA通过与蛋白结合形成RNA-蛋白复合物来发挥作用。

一方面，RBP参与RNA合成、可变剪接、修饰、转运、翻译及胞内.等多个转录后调控过程，调控mRNA稳定性、lncRNA活性、miRNA沉默复合体形成等生物学过程；另一方面，RNA也会调节这些蛋白质的活性、.或与其他蛋白质相互作用，从而影响RBP介导的各种细胞事件。RNA与蛋白质的相互作用对于维持细胞稳态是非常重要的，干扰这种相互作用将会导致细胞功能失调和相关疾病的发生。

目前研究RNA-蛋白质相互作用的方法分为两大类：一是以感兴趣的RNA为中心，寻找与该RNA结合的蛋白质；二是以感兴趣的蛋白质为中心，寻找与该蛋白质结合的RNA。RNA pull down属于前者，通过体外转录的方式将感兴趣的RNA带上标签，通过该标签使RNA结合到树脂支持物上，再加入样本蛋白质与RNA结合，洗涤、洗脱得到与目标RNA结合的蛋白质。

RNA pull-down 实验服务研究案例—客户文章解析

lncRNA LAMP5-AS1通过调控DOT1L甲基转移酶活性促进MLL白血病发展

研究背景

研究者们通过大量临床样本的检测发现，一个长链非编码RNA(LncRNA)“LAMP5-AS1”在混合系白血病(MLL)中高表达，因此进一步探索了LAMP5-AS1在MLL白血病发生发展中的作用。

研究路线

细胞和小鼠实验确定高表达的LAMP5-AS1促进MLL白血病进展RNA pull-down结合质谱鉴定技术首次发现了LAMP5-AS1的潜在结合蛋白—DOT1L（一种H3K79甲基转移酶）RIP qPCR实验确定了LAMP5-AS1与DOT1L结合截短型 RNA pull down实验进一步明确了与LAMP5-AS1结合的DOT1L结构域体外酶活实验表明LAMP5-AS1与DOT1L的结合促进了DOT1L的甲基转移酶活性RNA干扰结合ChIP实验表明LAMP5-AS1影响MLL融合蛋白核心靶基因的H3K79me2/3水平临床分析LAMP5-AS可作为MLL白血病不良预后的预测因子

研究结论

lncRNA LAMP5-AS1在MLL白血病细胞的自我更新过程和分化阻滞中起着重要的作用。LAMP5-AS1对维持DOT1L酶在MLL白血病中的高活性具有重要意义，可能成为治疗MLL白血病的一个有价值的靶点。

客户文献

Wang W.T. et al: The lncRNA LAMP5-AS1 drives leukemia cell stemness by directly modulating DOT1L methyltransferase activity in MLL leukemia. Journal of Hematology & Oncology. 2020. (IF=17.388)